Травяные креветки являются важным экономическим видом в пресноводной аквакультурной промышленности Китая. Однако в последние годыГепатопанкреатический микроспоридий(EHP), паразит, заражающий гепатопанкреас креветок, сильно повлиял на отрасль. Поскольку в настоящее время не существует эффективной лекарства или вакцины для лечения этого заболевания, быстрое и точное обнаружение имеет решающее значение для предотвращения его распространения.
A.magnified 9. 0 × 1 0 3 раза; B. Увеличено 5,0 × 104 раза.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Sianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Изоляция и морфологическое наблюдение гепатопанкреатического микроспоридия в литопенах -ваннамее. Журнал рыбных наук Китая, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Обнаружение EHP в первую очередь зависит от методов молекулярной биологии, причем технология ПЦР является наиболее распространенной. Тем не менее, хотя ПЦР предлагает высокую чувствительность, для этого требуется дорогостоящее оборудование для ПЦР и специализированную лабораторную среду, что делает его непригодным для использования в полевых условиях. Чтобы решить эту проблему, исследовательская группа разработала два метода быстрого обнаружения, основанные на технологии MIRA. Эти методы обеспечивают высокую чувствительность, быструю реакцию и легкую работу, что позволяет эффективно и быстро обнаружить EHP в креветках на месте без необходимости в сложном лабораторном оборудовании, таким образом заполняя пробел в методах обнаружения тока.
Реагенты усиления, используемые в исследовании:
- ДНК -изотермический набор быстрого усиления (базовый)
- ДНК -изотермический набор быстрого усиления (тип коллоидной золотой полосы)
Технология MIRA-это метод мульти-анцимы изотермической быстрого амплификации нуклеиновой кислоты. Его основной принцип включает в себя скоординированное действие множественных функциональных белков при температурах окружающей среды для достижения быстрого усиления нуклеиновой кислоты, что позволяет по-настоящему портативному обнаружению нуклеиновых кислот на месте.
Методы исследования
Извлечение образца
Исследовательская группа собрала как инфицированные, так и здоровые образцы креветок травы с трех креветочных ферм в провинции Ляонинг, извлекая ДНК из гепатопанкреас креветок.
Дизайн грунтовки
Три набора праймеров MIRA были разработаны, нацеленные на ген S8 серинового белка EHP (номер доступа Genbank: на 182063). Этот ген имеет уникальные активные участки, обеспечивая специфичность обнаружения.
Обнаружение Mira-Ege и Mira-LFD
(А) Оптимизированные температуры реакции RPA-возраста. М: маркер DL 500; N: отрицательный контроль; Штаммы 1-5: 25 градусов, 30 градусов, 37 градусов, 39 градусов и 42 градуса.
(Б) Оптимизированное время реакции RPA-EAGE. М: маркер DL 500; N: отрицательный контроль; 1: 10 мин; 2: 20 мин; 3: 30 мин; 4: 40 мин.
(C) Оптимизированные температуры реакции RPA-LFD. N: отрицательный контроль; 1: 25 градусов; 2: 30 градусов; 3: 37 градусов; 4: 39 градусов; 5: 42 градуса.
(D) Оптимизированное время реакции RPA-LFD. N: отрицательный контроль; 1: 5 мин; 2: 10 мин; 3: 20 мин.
Два метода обнаружения MIRA, Mira-Age (электрофорез с гелем агарозы) и MIRA-LFD (иммуноанализа с коллоидным золотом) были использованы для обнаружения EHP. Исследовательская группа оптимизировала температуры реакции и время посредством экспериментов. MIRA-Eage усилила ДНК-мишени за 30 минут на 37 градусов, в то время как MIRA-LFD завершила усиление всего за 10 минут при 37 градусах, при этом результаты читаются в течение 5 минут.
Экспериментальные результаты
Специфичность и чувствительность
(А) Специфичность обнаружения RPA-EAGE. М: маркер DL 1000; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: энцефалитозон; 3: Микроспоридия; 4: вирус синдрома белого пятна; 6: ненормальный; N: отрицательный контроль.
(Б) специфичность обнаружения RPA-LFD. P: Nosema Bombycis; N: отрицательный контроль; 1: EHP; 2: энцефалитозон; 3: Микроспоридия; 4: вирус синдрома белого пятна; 6: ненормальный.
(C) Чувствительность RPA-EAGE с градиентными разведениями рекомбинантных плазмид. М: маркер DL 500; N: отрицательный контроль; 1: 4,7 × 10^5 копий/мкл; 2: 4,7 × 10^4 копии/мкл; 3: 4,7 × 10^3 копии/мкл; 4: 4,7 × 10^2 копии/мкл; 5: 4,7 копии/мкл; 6: 4,7 копии/мкл.
(D) Чувствительность RPA-LFD с градиентными разведениями рекомбинантных плазмид. N: отрицательный контроль; 1: 4,7 × 10^5 копий/мкл; 2: 4,7 × 10^4 копии/мкл; 3: 4,7 × 10^3 копии/мкл; 4: 4,7 × 10^2 копии/мкл; 5: 4,7 копии/мкл; и 6: 4,7 копии/мкл.
Эксперименты продемонстрировали, что технология MIRA обладает высокой специфичностью, точно определяя EHP, не реагируя на другие патогены. С точки зрения чувствительности, оба метода имели предел обнаружения 4,7 копии/мкл, что значительно выше чувствительности традиционной ПЦР.
Клиническое испытание образца
Результаты тестирования 30 клинических образцов показали, что MIRA-AGE и MIRA-LFD имели позитивность 70%, что немного ниже, чем на 80%КПЦР, но значительно выше, чем традиционная ПЦР 56,7%.
Перспективы приложения
Методы обнаружения на основе MIRA позволяют быстро усилить гены-мишени при постоянных температурах. В частности, метод MIRA-LFD может обеспечить результаты всего за 10 минут без необходимости в сложном лабораторном оборудовании, что делает его идеальным для использования на сайте креветочных ферм. Высокая чувствительность и специфичность этой технологии делают ее эффективным инструментом для раннего обнаружения и контроля EHP, тем самым защищая здоровье и развитие травяной фермерской индустрии.
Среди этих методов иммуноанализ коллоидного золота бокового потока (MIRA-LFD) особенно подходит для применений на месте из-за его простоты и интуитивных результатов. Фермеры травяных креветок могут быстро обнаруживать и реагировать на инфекции EHP, улучшая возможности контроля заболеваний, значительно повышая эффективность сельского хозяйства и снижение экономических потерь.