《Создание метода обнаружения RhabDovirus Micropterus Salmoides на основе CRISPR CAS13A System Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing Systemts of Decetection Medepection для большого роти Bass Bass Flavirus на основе CRIS/CAS13. Китайский журнал гидробиологии, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus Salmoides, также известный как калифорнийский окунь или американский черный окунь, является пресноводной рыбой, родом из Северной Америки. В последние годы он стал важной рыбой, занимающейся сельскохозяйственной рыбой, из -за его высокого рыночного спроса: у микроптер -салмоида есть твердое мясо, мало костей, вкусной вкус, богатое питание, особенно с высоким содержанием белка и низкий уровень жира, что отвечает спросу потребителей на здоровую пищу. Следовательно, рыночная цена относительно высока, и она часто используется на рынке высококлассного общественного питания. Быстрый рост: Micropterus salmoides быстро растет и, как правило, может достигать товарных спецификаций в 6-8 месяцев. Он подходит для размножения с коротким циклом и может быстро реализовать инвестиционную прибыль. Сильная устойчивость к заболеваниям: по сравнению с другими фермерскими рыбами, микроптерсоидеса Salmoides обладает сильной адаптивностью к окружающей среде, менее крупномасштабными вспышками заболеваний и снижает риски размножения. Экологическое размножение: Bargemouth Bass может быть смешан с другими пресноводными рыбами, такими как серебряный карп и травяной карп, что помогает достичь экологического баланса пруда и максимизировать использование ресурсов, еще больше повысить эффективность размножения и другие факторы. Его приветствуют посетители и фермеры аквакультуры, и в последние годы его шкала размножения быстро росла.
Хотя Micropterus Salmoides относительно устойчивы к болезням, они все еще могут страдать от некоторых заболеваний при плохих условиях размножения. Среди них Micropterus Salmoides Rhabdovirus (MSRV) чрезвычайно вреден: он был впервые обнаружен во Флориде, США, в 1991 году. Вирус был первоначально обнаружен в популяциях диких крупных окуня, а затем постепенно распространился на многие пресноводные озера и резервуары в Соединенных Штатах, став одним из основных патогенов ловких басс.
Клинические симптомы больной рыбы
A: Здоровый крупный бас, стрелка указывает на желток; Б: больной бас с большим количеством, стрелка указывает на желток.
Источником передачи часто является инфицированная жареная или взрослая рыба, загрязненные водоемы и дикая рыба, несущая вирус; Этот вирус может передаваться с помощью прямого контакта, фекального экскреции и водоемов, и с большей вероятностью возникает в условиях плохого качества воды или в условиях размножения высокой плотности. диффузия. Вирус может вызвать летаргию, блуждающую, набухание в животе и искажение тела у ювенильной рыбы, а также вызывать некротические язвы и многоорганное кровотечение. После заражения уровень смертности превышает 90%.
Клинические симптомы искусственно инфицированных микроптерсоидес
A: Здоровый бас с большими руками; B, C, D: искусственно инфицированный бас с большим количеством
Каждый год более 30% фрая Micropterus Salmoides теряются из -за MSRV. В настоящее время методы лечения и обнаружения вируса по -прежнему незрелые, и нет конкретного лекарства для его лечения. Следовательно, очень необходимо обнаружить вирус во времени до заражения и принимать эффективные профилактические меры, что может в определенной степени снизить потери в процессе размножения;
Кроме того, трудно провести обнаружение на месте без сложного оборудования для обнаружения с существующей технологией обнаружения. Перед лицом этой проблемы исследовательская группа Сельскохозяйственного университета Южно-Китая разработала новый метод обнаружения, объединяющий MIRA с CRISPR-System. Этот метод обладает сильной специфичностью, высокой чувствительностью и простой работой, которая значительно повышает эффективность обнаружения MSRV, а также помогает обнаружить MSRV как можно раньше и принимать меры по профилактике и контролю.
Мира праймер комбинация комбинация
Две пары разных праймеров MIRA были использованы для амплификации фрагмента генов, содержащего последовательность целевого, и амплифицированные продукты подвергали электрофорезу агарозного геля. График электрофореза был расположен в положении 100 п.н., а яркие полосы появились во всех трех полосах, что указывает на то, что существуют неспецифические продукты амплификации. Амплифицированные целевые полосы при 250 п.н. на дорожках 2 и 3 были соответственно количественно проанализированы с помощью программного обеспечения Image J, а результаты количественного анализа были выражены с помощью «серого значения». Из результатов анализа можно сделать вывод, что чем ниже значение серого, тем выше скорость использования праймеров, то есть тем выше эффективность усиления связывания, специфичная для праймера.
Результаты показали, что специфическая эффективность амплификации связывания была высокой, когда использовалась пара праймеров MIRA-F2/R2.
MIRA PRIMER PARE SCREENGING Электрофорез гель изображение и анализ значений серого
а Электрофорез Lane M: 2000 п.н. Маркер ДНК; Электрофорез полоса 1. Отрицательное усиление образца ДНК; Электрофорез полоса 2. Пара праймеров MIRA-F1/R1 усиливает фрагмент мишени (224 п.н., как показано в коробке); Электрофорез-полоса 3. Пара праймеров MIRA-F2/R2 усиливает целевой фрагмент (255 п.н., как показано в коробке); беременный Анализ значения серого полосы (как показано в коробке)
CRISPR/CAS13A Система обнаружения
После завершения реакции системы обнаружения CRISPR/CAS13A она облучается ультрафиолетовым светом для наблюдения за результатами.
CRISPR/CAS13A Системная флуоресцентная диаграмма яркости флуоресценции
1-3. Вся система со стандартом РНК добавлена; 4. не добавила Crrna; 5. Белок Cas13a не добавлен; 6. Репортерный зонд SSRNA не добавлен; 7. Отрицательный контроль
CRISPR/CAS13A-MSRV Оптимальная реакционная система
Мы провели эксперименты с использованием стандартов РНК и амплифицированной РНК образца. Скорость позиционирования мишени РНК была лучше с Crrna2, чем с Crrna1. Crrna1 имел более сильный конечный флуоресцентный сигнал, чем Crrna2. Смешанное использование Crrna 1+ Crrna2 в равных пропорциях может сочетать преимущества обоих и достичь лучшей эффективности реакции.
Оптимизация условий реакции обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV и результатов обнаружения
а Сравнение результатов обнаружения стандартной РНК с использованием CRRNA с различными последовательностями спейсеров;
беременный Сравнение данных сигнала флуоресценции стандартной РНК, обнаруженной системой обнаружения при различных температурах;
в Сравнение данных сигнала флуоресценции стандартной РНК, обнаруженной с использованием РНК -репортерных зондов с различными концентрациями;
дюймовый Сравнение результатов обнаружения стандартной РНК, обнаруженной с использованием комплексов зондов Cas13a/CrRNA с различными соотношениями концентрации;
Чтобы исследовать влияние температуры реакции на систему обнаружения, были установлены различные температуры реакции 31 градуса, 34 градуса, 37 градусов и 41 градуса. Оптимальная температура реакции системы обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV составила 37 градусов.
Чтобы исследовать влияние концентрации зонда SSRNA на систему обнаружения, в пределах диапазона испытаний интенсивность флуоресценции положительно коррелировала с концентрацией зонда SSRNA. Эффект обнаружения концентрации зонда репортера SSRNA не сильно отличался при 500-700 nmol/l. Учитывая фактические экономические проблемы, оптимальная концентрация зонда SSRNA составила 500 нмоль/л.
Чтобы исследовать влияние различных соотношений концентрации реакции Cas13a и CrRNA на систему обнаружения, когда отношение Cas13a: CrRNA составляло 4: 1 и 3: 1 на основе отношения 100 нмоль/л на часть, Cas13a достиг насыщения; Когда количество CAS13A было постоянным, интенсивность сигнала флуоресценции не была положительно коррелирована с увеличением количества CRRNA. Следовательно, когда соотношение CAS13A и CRRNA составляет 2: 1, система обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV может достичь максимальной активности обнаружения.
Оценка чувствительности
Чтобы исследовать минимальную концентрацию обнаружения MSRV с помощью системы обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV, стандарт РНК разбавляли 10 раз в серии и обнаруживали системой обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV. Система обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV может обнаружить не менее 100 фунтов стерлингов РНК-мишени MSRV. Когда концентрация мишени РНК ниже 100FM, сигнал флуоресценции, обнаруженный машиной, существенно не отличается от концентрации пустого контроля. Следовательно, система обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV может обнаружить не менее 100 фунтов стерлингов MSRV SSRNA.
Оценка специфичности системы обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV для MSRV
Образец тестирования
Для образцов больных рыб с очевидными признаками заболеваний, собранных на морских окунях, мы подтвердили, был ли патоген, инфицированный больной рыбой, был MSRV. Мы использовали праймеры, специфичные для последовательности капсидного белка MSRV для амплификации ПЦР, и отправили соответствующие полосы на диаграмме электрофореза для тестирования. После сравнения мы подтвердили, что это был MSRV.
Подтверждение информации о последовательности MSRV
а ПЦР амплификация 228 п.н. полоса продукта праймеров MSRV; беременный Последовательность капсида капсида MSRV по сравнению с NCBI, BOLD-последовательностями представляют собой сайты связывания праймеров вверх по течению и нижестоящие направления, а заштрихованные области являются местоположениями для связывания CRISPR/CAS13A-MSRV CRRNA1
Образцы больных рыб, инфицированные MSRV, были предварительно обработаны и предварительно предварительно предварительно для вирусной РНК, а затем протестировали с помощью отрицательной контрольной группы. В то же время кДНК образцов была извлечена для сравнения с обычным QPCR. Положительные образцы (№ 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 и 15), обнаруженные системой обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV, были такими же, как и результаты обычного QPCR, где значение CQ QPCR составляло от 18 до 25; в то время как пороговое цикл количество отрицательных образцов (№ 1, 2, 4, 5, 9, 10 и 11) было больше 38, что указывает на то, что образцы не несут вирус MSVR. Таким образом, данные об обнаружении системы обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV и обычной RT-QPCR были согласованы, что указывает на то, что система обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV может в определенной степени.
Вертикальная сравнительная диаграмма образцов данных обнаружения QPCR с QPCR и CRISPR
а Обнаружение QPCR схемы номера порогового цикла клинического цикла MSRV; Обнаруженный номер цикла образца сравнивался с отрицательным номером опорного цикла с использованием анализа t-тестов (** p<0.01);
беременный CAS13A в сочетании с обнаружением MIRA клинической флуоресцентной диаграммы MSRV; Значение флуоресценции обнаруженного образца сравнивалось с отрицательным значением флуоресценции с использованием анализа T-тестов (** P<0.01)
Таким образом, метод обнаружения CRISPR/CAS13A-MSRV, установленного в этом исследовании, не требует дорогостоящих экспериментальных инструментов, что делает обнаружение на месте быстрым, точным и удобным. Следовательно, если этот метод обнаружения используется для своевременного обнаружения MSRV в фактическом процессе размножения и принятия целевых и эффективных мер, он может значительно снизить потери, вызванные заболеваниями в процессе размножения. Кроме того, этот метод обнаружения быстрый, высоко чувствительный и специфический, и имеет отличные перспективы применения и продвижения.