《Разработка нового CAS13A/CAS12A-опосредованного"One Pot" двойной Анализ обнаружения для генетически модифицированных культур экспрессируется
Генетически модифицированные культуры были широко посажены по всему миру, и многие страны постепенно улучшали свои нормативные меры для обеспечения безопасности генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. Разработка быстрых и точных методов генетического обнаружения на месте очень важна для сельского хозяйства и биобезопасности и может облегчить общественные опасения по поводу генетически модифицированных продуктов.
В этом исследовании исследовательская группа разработала новую реакцию с одним POT -- двойное обнаружение MIRA в сочетании с двойным CRISPR (метод MR-DCA) для одновременного обнаружения CAMV35S и NOS-генетических мишеней в генетически модифицированных культурах, обеспечивая простой и эффективный метод обнаружения для обнаружения генетически модифицированных сельскохозяйственных культур.
Экспериментальные методы
Двойной продукт MIRA анализируется двойной системой CAS13A и CAS12A, чтобы генерировать два независимых сигнала, которые не мешают друг другу, а затем флуоресцентный цвет читается инструментом освещения или тестовой полосой с двумя линиями T для достижения двухканальной считывания. Весь процесс завершается менее чем за 35 минут, с пределом обнаружения всего 20 экземпляров.
(Принцип обнаружения MR-DCA CAMV35S и NOS)
Весь эксперимент разделен на три этапа: амплификация MIRA, реакция CRISPR и два метода интерпретации результатов.
Ген CAMV35S используется в качестве мишени CAS13A, а ген NOS используется в качестве мишени CAS12A. Две пары праймеров MIRA были разработаны соответственно. Система CAS13A распознает только РНК, поэтому разработанная область форвардного праймера, которая содержит промотор T7 для последующей транскрипции и активации CAS13A. Пэм добавляется в ген NOS. Вышеупомянутые дополнения гарантируют, что как белки Cas13a, так и Cas12a могут связываться с их соответствующими CRRNAs, и между этими двумя системами нет помех или перекрестной реакции.
Экспериментальная ситуация
Чувствительность и специфичность
Образец разбавляли в градиенте, чтобы проверить интенсивность флуоресценции реакции MIRA. Было обнаружено, что интенсивность флуоресценции все еще может быть обнаружена при концентрации образца 20 мкл. Концентрация 20 мкл была окончательно выбрана для эксперимента.
(Различные концентрации выборки и тестовые полоски используются для расчета развития цвета и количественной оценки интенсивности)
Чтобы дополнительно оценить специфичность MR-DCA, исследовательская группа проверила смешанные образцы не трансгенных животных и не трансгенных растений. Результаты показали, что только трансгенные образцы, содержащие CAMV35S и NOS, имели высокие флуоресцентные сигналы, в то время как интенсивность флуоресценции других образцов была близка к интенсированию отрицательного контроля. MR-DCA может использоваться в качестве специфической платформы для обнаружения нуклеиновых кислот с двойной целью.
24 образца урожая были протестированы MR-DCA. Среди них 1, 2, 15, 16, 21 и 22 - трансгенная кукуруза, содержащая промотор CAMV35S. 7, 8, 23 и 24-это устойчивый к болезням трансгенный рис, содержащий NOS-терминатор. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 и 18 - это трансгенные соевые бобы, содержащие промотор CAMV35S и терминатор NOS.
(Результаты испытаний 24 образцов)
Быстрая реакция
Время реакции является важным фактором в обнаружении на месте. Исследовательская группа отметила, что флуоресцентные сигналы FAM и HEX могут быть обнаружены флуоресцентным инструментом, когда время реакции составляло 10 минут. Мира в сочетании с реакцией CRISPR также наблюдала желтую флуоресценцию через 15 минут.
(Сигнал флуоресценции в разные время реакции MIRA)
(Разработка цвета испытательных полос в разные время реакции MIRA и расчет количественной оценки интенсивности)
Экспериментальный вывод
Экспериментальные результаты показали, что двойная MIRA имеет хорошую специфичность и может точно получить продукты амплификации CAMV35S и NOS. Системы CAS13A и CAS12A реагируют независимо, не мешая друг другу. Тест MR-DCA может точно обнаружить 20 копий при низкой температуре 35 минут, что имеет большое значение при обнаружении генетически модифицированных культур в полевых условиях.
Информация о статье
Название журнала: 《Журнал Advanced Research Express
Название статьи: 《Разработка нового анализа двойного обнаружения, опосредованного CAS13A/CAS12A, для генетически модифицированных культур экспрессии
Ударный фактор: 11.4
Исследовательская группа: Ван Сяофу, Академия сельскохозяйственных наук Чжэцзян