Видимое и быстрое обнаружение чафамапарвовируса кошек с использованием мультиферментной изотермической быстрой амплификации и анализа с помощью тест-полосок в латеральном потоке.
Журнал:Границы клеточной и инфекционной микробиологии
Импакт-фактор:4.6
Кошачий чафамапарвовирус(ФеЧПВ)— это новый парвовирус, впервые обнаруженный у кошек с диареей в Канаде в 2019 году. Его патогенность и молекулярные характеристики остаются неясными, он демонстрирует разнообразие хозяев и генетическое разнообразие, что требует дальнейшего эпидемиологического исследования. В настоящее время не существует стандартизированного метода обнаружения FeChPV.
Метод мультиэнзимной изотермической быстрой амплификации-щупом с боковым потоком (MIRA-LFD)успешно используется для обнаружения различных вирусов, предлагая такие преимущества, как быстрота, простота и отсутствие необходимости в точных инструментах. Исследовательская группа разработала метод MIRA-LFD, подходящий для FeChPV, для решения проблем массового клинического выявления. Не полагаясь на точные инструменты,метод MIRA-LFD позволил обнаружить FeChPV при температуре 37 градусов за 20 минут и не показал перекрестной-реактивности с другими вирусами. Предел обнаружения составил 32,3 копий/мкл.В 10 раз выше, чем методом ПЦР. Кроме того, метод MIRA-LFD выявил 29 FeChPV-положительных образцов среди 417 кошек с диареей, причем уровень положительных результатов немного выше, чем при использовании метода гнездовой ПЦР. Эти результаты показывают, что признанный метод MIRA-LFD для обнаружения FeChPV является эффективным, экономичным, надежным и простым методом, способствующим ранней профилактике и контролю инфекции FeChPV.
1. Экспериментальные методы
Клинические образцы:Образцы мазков из прямой кишки, использованные в этом исследовании, были собраны у 632 кошек (в том числе 417 с диареей и 115 здоровых кошек) и 474 собак (в том числе 342 с диареей и 132 здоровых собак) в ветеринарных клиниках провинций Гуандун, Хэнань, Аньхой, Чжэцзян и автономного района Внутренняя Монголия в период с 2022 по 2024 год.
Амплификация нуклеиновых кислот:Экстрагированную ДНК-нуклеиновую кислоту добавляли в систему MIRA. Рекомбиназа и праймеры образовали комплекс; с помощью вспомогательных белков и одноцепочечных связывающих белков они вторглись в двухцепочечную ДНК-матрицу. Праймеры связываются с гомологичными комплементарными областями, образуя область петли D-, в то время как рекомбиназа отделяется от комплекса. Полимераза связывается с 3'-концом праймера и инициирует синтез ДНК, экспоненциально амплифицируя целевой участок на матрице. Этот процесс происходил быстро и эффективно, тем самым достигая сверх-быстрой амплификации целевого фрагмента всего за 15 минут.
Изменение цвета тест-полоски:Продукт амплификации нуклеиновой кислоты разбавляли 1:10, наносили на тест-полоску и результаты считывали через 5 минут.
Весь процесс от амплификации нуклеиновой кислоты до изменения цвета тест-полоски занял всего 20 минут.
В эксперименте использовались биопрепараты Amp-будущего:
В ходе исследования были проверены четыре разработанных набора конкретных комбинаций праймеров-зондов. Для представления результатов использовали как электрофорез в агарозном геле, так и тест-полоски для определения нуклеиновых кислот. Все четыре комбинации праймеров-зондов смогли обнаружить вирус FeChPV. По результатам электрофореза в агарозном геле комбинация FeChPV-4 показала наиболее яркую целевую полосу, поэтому именно эта комбинация была выбрана для последующего тестирования.
Согласно результатам электрофореза в агарозном геле, амплификация в течение 5, 10, 15 и 20 минут давала целевую полосу. Интенсивность целевой полосы достигла максимума через 15 минут амплификации, что определило 15 минут как оптимальное время реакции для этого анализа. Амплификация при 36, 37, 38, 39 и 40 градусах давала целевую полосу, причем самая яркая полоса наблюдалась при 39 градусах, что определяло 39 градусов как оптимальную температуру реакции для этого анализа.
(Рисунок A: 1: Амплификация 5 минут; 2: Амплификация 10 минут; 3: Амплификация 15 минут; 4: Амплификация 20 минут) (Рисунок B: 1: Амплификация 36 градусов; 2: Амплификация 37 градусов; 3: Амплификация 38 градусов; 4: Амплификация 39 градусов; 5: Амплификация 40 градусов)
2. Производительность обнаружения
Чувствительность:
(Рисунок A: Результаты MIRA, представленные с использованием электрофореза в агарозном геле)
(Рисунок B: Результаты вложенной ПЦР, представленные с использованием электрофореза в агарозном геле)
(Рисунок C: Результаты MIRA, представленные с использованием тест-полосок на нуклеиновые кислоты)
Образцы подвергали 10-кратным серийным разведениям, начиная с 3,23×10⁶ копий/мкл. Вложенная ПЦР с электрофорезом в агарозном геле могла стабильно обнаруживать 3,23×10² копий/мкл; MIRA с электрофорезом в агарозном геле и MIRA с тест-полосками для нуклеиновых кислот могли стабильно обнаруживать 3,23×10¹ копий/мкл.
Метод MIRA показал постоянную чувствительность при использовании двух разных форматов представления результатов, а чувствительность метода MIRA превосходила чувствительность вложенной ПЦР.
Специфика:
(1: FeChPV, чафамапарвовирус кошек; 2: FPV, вирус панлейкопении кошек; 3: FeAstV, астровирус кошек; 4: FBoV, бокавирус кошек; 5: CachaV, чапарвовирус собак; 6: отрицательный контроль)
Недавно созданный метод MIRA-LFD выявил только FeChPV и не показал перекрестной-реактивности с другими эталонными вирусами, что указывает на хорошую специфичность.
3. Резюме исследования
В результате этого исследования был разработан метод MIRA-LFD для обнаружения FeChPV без необходимости использования высокоточных-инструментов. Являясь эффективным, экономичным и надежным методом обнаружения с высокой чувствительностью и специфичностью, метод MIRA-LFD больше подходит для клинического выявления, обеспечивая техническую поддержку для ранней профилактики и контроля инфекции FeChPV.
4.AMP-БИОТЕХНОЛОГИИ БУДУЩЕГО
Мультиферментная изотермическая быстрая амплификация нуклеиновых кислот MIRA – это технология, которая действительно обеспечивает быстрое обнаружение-на месте.
Технология MIRA основана на механизме рекомбинации генов in vivo, основанном на синергическом действии множества функциональных белков при комнатной температуре для достижения быстрой (5-20 минут), чувствительной, специфичной и безопасной амплификации нуклеиновых кислот при комнатной температуре (25–45 градусов). Благодаря изотермическому характеру технологии MIRA она требует низких требований к оборудованию и проста в эксплуатации. Благодаря миниатюрным портативным устройствам его можно применять на переднем крае тестирования в различных сценариях применения, обеспечивая быстрое и точное тестирование нуклеиновых кислот в таких условиях, как POCT, домашнее тестирование, сельскохозяйственные поля и правоохранительные органы-на местах. На основе технологии MIRA компания Amp-future Biotech разработала серию продуктов для быстрого молекулярного тестирования на-объектах, включая агенты быстрого высвобождения нуклеиновых кислот, изотермические реагенты для быстрой амплификации нуклеиновых кислот, тест-полоски с коллоидным золотом и миниатюрное портативное оборудование, создавая комплексное решение для быстрого молекулярного тестирования на-площадке. Кроме того, технология MIRA от Amp-future предлагает преимущества применения в сочетании с технологией CRISPR, NGS, SNP, микрофлюидикой и многим другим.
В дополнение к серии продуктов для-быстрого тестирования на месте, показанной выше, Amp-future Biotech также предлагает:
Реагенты для исследования:Обеспечение реагентным сырьем и технической поддержкой фундаментальных научных исследований, а также справочной информацией по проектной литературе.
OEM производство:Возможность независимого производства готовой продукции высокой-чистоты и-активности на протяжении всего процесса, достигая промышленного-производства.
Разработка проекта по заказу:Информация о последовательностях и результаты анализа выравнивания последовательностей, разработка и синтез праймеров-зондов проекта, синтез и образцы плазмид проекта, отчеты и результаты проекта и т. д.
Для получения дополнительной информации, добро пожаловать на запрос.