Обмен статьями 丨Микрофлюидная платформа с усовершенствованным искусственным интеллектом-CRISPR-Cas14a для точного-обнаружения геминивирусов на растениях томата и белокрылки на месте.

Геминивирусы представляют серьезную угрозу мировому производству томатов из-за быстрой эволюции и всемирной передачи, опосредованной белокрылкой. Современные методы обнаружения в первую очередь нацелены на растения с симптомами, часто обеспечивая диагностические результаты только после того, как вирусная нагрузка достигла трансмиссивного уровня, что делает борьбу с заболеванием неэффективной. Раннее вмешательство зависит от выявления инфекций до появления симптомов-или даже обнаружения присутствия вируса у насекомых-переносчиков до того, как они передают вирусы растениям. Хотя недавние достижения в области изотермической амплификации и диагностики на основе CRISPR- предлагают потенциальные решения, практическая реализация сталкивается с присущими ограничениями: несовместимостью между системами ферментативной амплификации и CRISPR, рисками загрязнения в результате многоэтапных процедур и недостаточной адаптируемостью устройств обнаружения в полевых условиях. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали MaC14a-микрофлюидную платформу с усовершенствованным искусственным интеллектом-, объединяющую асимметричную мультиферментную изотермическую быструю амплификацию (aMIRA) с CRISPR-Cas14a. Эта система преодолевает ключевые технические барьеры за счет оптимизации стехиометрии праймеров для генерации оцДНК для PAM-независимой активации Cas14a, достижения сверхчувствительного обнаружения (10 фМ) и устранения перекрестного-загрязнения посредством реакций в одной-пробирке. В сочетании с центробежным микрофлюидным чипом, портативным оптическим детектором и интерпретацией сигналов на основе машинного обучения MaC14a обеспечивает мультиплексное обнаружение четырех геминивирусов в течение 5 минут, демонстрируя 100 % диагностическую точность как для образцов растений, так и белокрылки. Ее достижения включают в себя: (i) предсимптомное обнаружение инфекции у растений и (ii) точное определение носительства вируса у отдельных белокрылок,-заполняющее критический технологический пробел в надзоре до-передачи инфекции. Это исследование не только предоставляет новый инструмент для борьбы с геминивирусами, но и устанавливает парадигму «ИИ-CRISPR-микрофлюидики» для защиты сельскохозяйственных культур. Смещая акцент с растений с симптомами на вирулиферирующие переносчики и бессимптомные инфекции, эта технология предлагает преобразующее решение для нарушения циклов передачи вируса в их источнике.

Интегрированный рабочий процесс системы MaC14a для множественного надзора за геминивирусами.

(A) Механизм обнаружения нуклеиновой кислоты, опосредованного aMIRA-Cas14a-. Схема, иллюстрирующая амплификацию оцДНК, управляемую aMIRA-, в сочетании с независимым от PAM распознаванием оцДНК Cas14a и побочной активностью расщепления, что позволяет обнаруживать в одной-пробирке (совместимо с приборами флуоресцентной ПЦР в реальном времени) или-микрофлюидный анализ на месте (с помощью специально-разработанных центробежных устройств обнаружения). (B) Рабочий процесс микрофлюидного обнаружения (MaC14a) для развертываемой в полевых условиях диагностики. Временные этапы обозначены стрелками, показывающими продолжительность каждого процесса в портативном анализаторе. (C) Блок-схема алгоритма обнаружения в реальном-времени на основе сетей с долговременной-памятью (LSTM). Оптимизированный алгоритм облегчает обработку сигналов флуоресценции в реальном времени, позволяя интерпретировать результаты в течение 5–10 минут.

Система обнаружения aMIRA-Cas14a

(A) Схематическая диаграмма иллюстрирует механизм реакции платформы обнаружения aMIRA-Cas14a. (B) Специфическая активность расщепления Cas14a на продуктах aMIRA была подтверждена с помощью анализа гель-электрофореза. (C) Сравнительный анализ одно- и двух-этапных методов обнаружения aMIRA-Cas14a. Примечание. В протоколе двухэтапной реакции процесс начинается с 20-минутной амплификации aMIR, за которой следует добавление системы обнаружения Cas14a для мониторинга флуоресценции. Следовательно, сбор сигналов флуоресценции начинается через 20 минут. (D) и (E) Эксперименты по оптимизации были проведены для определения оптимальных соотношений прямого и обратного праймеров. (F – I) Специфичность системы aMIRA-Cas14a была подтверждена путем обнаружения четырех различных вирусных мишеней (TYLCCNV, TYLCV, TOLCNDV и TbCSV) в образцах растений. Смешанный образец (обозначенный как «Смесь») готовили путем объединения равных объемов каждого препарата вирусной ДНК.

Чтобы добиться амплификации сигнала для следовых количеств вирусных нуклеиновых кислот и обеспечить достаточное количество субстратов для Cas14a, мы разработали aMIRA (асимметричная мультиферментная изотермическая быстрая амплификация) на основе MIRA. Полученная система aMIRA-Cas14a обладает следующими ключевыми преимуществами:

1. Оптимизированная стехиометрия праймеров позволяет MIRA преимущественно перепроизводить оцДНК, которая служит прямым субстратом для Cas14a. Регулируя соотношение прямого-и-обратного праймеров до 20:1, система генерирует достаточное количество оцДНК для активации PAM-независимой активности расщепления Cas14a, которая специфически распознает и расщепляет оцДНК.
2. Интеграция MIRA и CRISPR-Cas14a в одном сосуде исключает риски перекрестного загрязнения.
3. MIRA значительно повышает чувствительность обнаружения, позволяя обнаруживать вирусные нуклеиновые кислоты со сверхнизким содержанием.
4. aMIRA-Cas14a сохраняет высокую специфичность, избегая ложноположительных результатов, вызванных неспецифической амплификацией.

В конечном счете, комплексная интеграция MIRA и CRISPR-Cas14a устраняет риски загрязнения и обеспечивает идеальное взаимодействие сильных сторон MIRA и системы CRISPR-Cas14a. Это решает общеотраслевую проблему несовместимости систем изотермической амплификации и CRISPR, что представляет собой основной технологический прорыв платформы MaC14a. Система aMIRA-Cas14a обеспечивает 1000-кратное улучшение чувствительности, обеспечивая при этом удельное усиление. В сочетании с распознаванием последовательности Cas14a это обеспечивает двухуровневую проверку специфичности без перекрестной реактивности против нецелевых вирусов или здоровых образцов-, что решает еще одну проблему отрасли: склонность к ложноположительным результатам.

Мультиферментные изотермические реагенты для быстрой амплификации MIRA, использованные в этом исследовании, были предоставлены компанией Amp‑Future (Чанчжоу) Biotech Co., Ltd. Помимо превосходных характеристик реагентов, Amp‑future Biotech также предлагает профессиональную и быстро реагирующую команду технической поддержки.

MIRA демонстрирует высокую совместимость с микрофлюидными чипами на основе центрифуг-, разработанными для исследовательских и диагностических целей:

1. Миниатюрная реакционная система, подходящая для реакционных камер микро-объема, характерных для микрофлюидных чипов;
2. Возможность мультиплексного обнаружения за один проход;
3.Совместимость с портативными устройствами, плавный рабочий процесс от образца до результата.

Портативный анализатор и архитектура чипа.

(A) Разобранный вид портативного устройства обнаружения с указанием основных компонентов. (B) Модульная архитектура центробежного микрофлюидного чипа. (C) Жидкостный контроль с помощью центрифугирования. Анализ траекторий транспорта жидкости под действием программируемых центробежных сил.

мы разработали интегрированное портативное устройство для тестирования-на входе и ответа-на выходе-из-пункта оказания медицинской помощи (POCT), оптимизированное для развертывания в полевых условиях, как показано на рис.. 4A. Компактный прототип (23 см (Д) × 21 см (Ш) × 14 см (В), общая масса 12,5 кг) обеспечивает исключительную портативность. Основные компоненты системы включают высокоточный-серводвигатель для точного контроля вращения и блок нагрева воздуха для регулирования температуры. Встроенный модуль оптического обнаружения, расположенный под чипом, облегчает возбуждение и измерение флуоресценции, обеспечивая высокую чувствительность и точность обнаружения. Портативное устройство оснащено встроенной операционной системой Android, предлагающей удобный-интерфейс, в котором операторы могут выбирать предварительно запрограммированные рабочие файлы, содержащие подробные параметры, такие как время реакции и температура. Результаты и заключения отображаются в режиме-времени на ЖК-экране, что позволяет быстро получать информацию. Кроме того, система включает в себя модуль беспроводной связи, который поддерживает передачу данных в-режиме реального времени на мобильные устройства или облачные серверы, интегрируясь с алгоритмами искусственного интеллекта для немедленной интерпретации и анализа результатов испытаний.

news-800-847

Чтобы оценить способность системы MaC14a обнаруживать вирусное носительство у насекомых-переносчиков, мы провели анализы сбора TYLCV с использованием

Популяции Bemisia tabaci. Белокрылкам давали 3-дневный период кормления на растениях, инфицированных TYLCV, а затем обрабатывали через

Система MaC14a (рис. D). Последующий анализ показал, что 8 из 10 протестированных белокрылок (80%) демонстрировали положительные вирусные сигналы (рис. E). Важно отметить, что все образцы из группы отрицательного контроля (кормленные исключительно здоровыми растениями) сохраняли базовые уровни флуоресценции. Эти результаты показывают, что система MaC14a может точно идентифицировать вирус-переносчик белокрылок на индивидуальном уровне, подчеркивая ее потенциал для мониторинга и контроля передачи вируса в сельскохозяйственных условиях.

В последующем двойном-слепом проверочном эксперименте мы протестировали 20 образцов листьев томатов (S1–S20), собранных в двух тепличных зонах выращивания в Ханчжоу, провинция Чжэцзян, Китай, и в двух теплицах.Зоны выращивания в Наньнине, провинция Гуанси, Китай. Каждая зонапредоставили пять образцов листьев томата, демонстрирующих типичные симптомы вируса.инфекция (например, хлороз, мозаичная крапчатость и скручивание листьев) и пятьбелокрылки (всего 20). Система MaC14a с усовершенствованной ИИ-доставлена повторнорезультаты на 5-й минуте, которые полностью соответствовали полученнымиз 60-минутного анализа aMIRA-Cas14a и платформы qPCR, демонстрируяСогласие 100 % (рис. F, S6-S7, таблица S3). Кроме того, вирусВиды, обнаруженные в образцах растений, полностью соответствовали видам, обнаруженным в образцах растений.выявлены у насекомых-переносчиков из той же зоны культивирования. ЭтиРезультаты подчеркивают значительный потенциал-улучшенного ИИ MaC14a в-сайт вирусной диагностики растений, достигая высокой скорости (из нуклеиновой кислотыизвлечение результатов всего за 10 минут), высокая точность (постояннаяс результатами qPCR) и портативность.