В статье предлагается новая технология микрофлюидных чипов для мультиплексного обнаружения патогенных микроорганизмов креветок. Исследовательская группа интегрировала технологию изотермической амплификации мультинцимов (MIRA) и методов обнаружения флуоресценции в реальном времени. Этот микрофлюидный чип обеспечивает быстрое, чувствительное и эффективное решение для обнаружения на месте основных патогенов креветок.
Исследовательский опыт и значение
Глобальная индустрия сельского хозяйства креветок является одним из наиболее важных экономических компонентов в аквакультуре, но отрасль уже давно сталкивается с угрозами со стороны различных патогенных микроорганизмов. Эти патогенные микроорганизмы часто приводят к крупномасштабной гибели креветок, серьезно влияя на производство и экономические выгоды. Включая острую болезнь некроза гепатопанкреата (AHPND), вирус синдрома белого пятна (WSSV), инфекционный вирус гиподермального и гемопоэтического некроза (IHHNV), иридовирус гемоцитов креветок (SHIV) и энтерогепатику (EHP) и т. Д., Бактерия и парас.
Традиционные методы обнаружения патогенов, такие как полимеразная цепная реакция (технология ПЦР), имеют высокую чувствительность и специфичность, но сложны для работы, занимают много времени и полагаются на лабораторное оборудование. Эти ограничения делают технологию ПЦР непригодной для быстрого тестирования на месте. Технология MIRA стала инструментом молекулярного обнаружения, подходящего для применения на месте из-за его быстрого усиления характеристик при постоянной температуре и нормальной температуре.
Мира технологический принцип
Многогензимная постоянная температурная технология быстрого усиления нуклеиновых кислот (технология MIRA) представляет собой технологию усиления постоянной температуры, которая опирается на синергию множества функциональных белков при комнатной температуре для достижения быстрого усиления нуклеиновых кислот. Это действительно портативная технология обнаружения быстрых нуклеиновых кислот на месте. По сравнению с ПЦР, у Мира больше преимуществ.
Дизайн и инновации микрофлюидных чипов
Схематическая схема платформы обнаружения RPA на чипе для нескольких важных патогенных микроорганизмов креветок
(А) Структура микрофлюидного чипа типа диска. 1: реакционная камера; 2: шариковый клапан; 3: выхлопный порт; 4: порт отбора проб;
(Б) взорвался представление. 5: пленка тепла; 6: Чип -субстрат.
(C) Детальная планировка шести наборов праймеров в секторе. Каждый набор праймеров предварительно фиксирован в назначенной реакционной камере.
(D) Полная платформа обнаружения RPA в операционной процедуре.
В статье предлагается микрофлюидный чип, интегрированный с технологией MIRA для мультиплексного обнаружения патогенных микроорганизмов креветок. Микрофлюидная технология может контролировать жидкости в каналах микронного уровня для точных манипуляций, тем самым достигая эффективного и недорогого многоцелевого обнаружения.
Чип имеет следующие ключевые функции дизайна:
● Центробежный микрофлюидный чип
Чип принимает конструкцию центробежного привода, используя центробежную силу для равномерно распределения образца в каждую реакционную камеру. Эта конструкция упрощает процесс работы, и оператор может завершить всю реакцию, просто введя образец.
● Многоцелевое обнаружение
Чип предварительно введен с помощью бактериальных типов, которые необходимо обнаружить: острый гепатопанкреатический некроз (V-AHPND), вирус синдрома белого пятна (WSSV), инфекционный подкожный вирус некроза (IHHNV), гемоцир-гемоцит из креветок (EHP). ) Праймер зондов для пяти патогенных микроорганизмов. Эта конструкция может одновременно обнаружить шесть генных мишеней в одной реакции, обеспечивая быстрый скрининг множественных патогенных микроорганизмов.
● Обнаружение флуоресценции в реальном времени
Реакция амплификации технологии MIRA в чипе объединяется с флуоресцентным зондом, который может контролировать прогресс реакции усиления в режиме реального времени. Конструкция зонда позволяет высвобождению флуоресцентного сигнала только при создании продукта амплификации, что достигает быстрого и чувствительного количественного обнаружения.
● Система реакции низкой концентрации
Каждая реакционная единица чипа требует только реакционного объема 5 мкл, что значительно снижает потребление реагентов. Когда вся система работает, до четырех образцов может быть обработано одновременно, и каждый образец может обнаружить пять патогенных микроорганизмов, значительно повышая эффективность обнаружения.
Чувствительность, специфичность и повторяемость
Производительность системы чипов включает в себя обнаружение симметрии, резонанса и повторяемости.
● Чувствительность
Результаты эксперимента показывают, что чип может обнаружить количество копий гена целевого гена всего 10 копий/мкл, с чувствительностью, которая сопоставима или даже выше традиционных методов ПЦР. Эта высокая чувствительность гарантирует, что технология может обнаружить ранних инфицированных людей в практических применениях, что обеспечивает раннее скринингова патогенов.
● Специфика
Эксперимент провел тесты по перекрестной реакции на различных нецелевых патогенах, и результаты показали, что чип очень специфичен для целевых патогенов и может точно различать различные типы патогенных микроорганизмов. All tests for Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (V-AHPND), White Spot Syndrome Virus (WSSV), Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV), Shrimp Hemacytic Iridescence Virus (SHIV) and Enterohepatitis Hepatica (EHP) The results all showed no cross-reaction, indicating that this method can effectively avoid неспецифическое усиление.
● Повторяемость
Чтобы оценить стабильность метода, исследовательская группа провела несколько повторяющихся экспериментов. Результаты показали, что коэффициент изменения (значение CV) между различными экспериментами составляло менее 10%, что показало хорошую экспериментальную повторяемость и согласованность.
Полевые приложения и преимущества
Дизайн технологического микрофлюидного чипа MIRA дает ему значительные преимущества полевых применений, особенно подходящие для быстрого обнаружения и мониторинга патогенов в фермерских фабриках:
● Удобный процесс работы
Весь процесс обнаружения требует только введения образца в чип и запуска реакционного устройства. Это практически не требует ручной работы и подходит для непрофессионалов для использования на месте.
● Быстрая возможность ответа
Система может получить результаты испытаний в течение 20 минут, значительно сокращая время испытания. Это имеет решающее значение для быстрого реагирования на заболевание на фермах и уменьшения распространения патогенов.
● Возможность обнаружения мультиплекса
Пять основных патогенных микроорганизмов могут быть идентифицированы в одном тесте, что значительно повышает эффективность обнаружения и экономит затраты и время обнаружения.
Мира технологические перспективы
Несмотря на то, что технология ПЦР давно оценивается в качестве золотого стандарта для обнаружения усиления нуклеиновых кислот, технология MIRA продемонстрировала большой потенциал применения из -за своей быстрой реакции при постоянной температуре, простой эксплуатации и низких требованиях к оборудованию. Сравнивая с ПЦР в сочетании с секвенированием ДНК, было обнаружено, что результаты обнаружения чипа изотермической амплификации согласуются с результатами ПЦР с точки зрения чувствительности и специфичности, а время реакции технологии MIRA значительно сокращается. Следовательно, микрофлюидные чипы MIRA, считаются технологией, более подходящей для полевых приложений, особенно в средах, которые требуют быстрого и крупномасштабного обнаружения патогенов.
Микрофлюидные чипы, основанные на технологии мультинзиментной изотермической быстрого амплификации нуклеиновой кислоты (MIRA), обеспечивают эффективный инструмент для обнаружения патогенных микроорганизмов при выращивании креветок. Эта технология обладает преимуществами высокой чувствительности, хорошей специфичности, легкой работы и быстрого обнаружения и имеет широкие перспективы применения в профилактике и контроле заболевания аквакультурами. При дальнейшей разработке и оптимизации технологии, как ожидается, система будет применяться к обнаружению более водных патогенов, что позволяет более широко профилактике и мониторинге заболевания.
Результаты исследований обеспечивают надежный метод раннего обнаружения для индустрии аквакультуры, который может эффективно снизить риск вспышек заболеваний, повысить эффективность производства и производство ферм и заложить техническую основу для устойчивого развития аквакультурной промышленности.