Флуоресцентная поляризация (FP) - это мощный метод, используемый в различных областях, включая биохимию, фармакологию и науку об окружающей среде. Как ведущий поставщик детектора флуоресценции, мы понимаем важность точных и надежных измерений FP. В этом сообщении мы рассмотрим, как измерить поляризацию флуоресценции, от основных принципов до практических соображений.
Основные принципы поляризации флуоресценции
Поляризация флуоресценции основана на том факте, что когда флуоресцентная молекула возбуждается поляризованным светом, излучаемый свет также поляризован. Степень поляризации испускаемого света зависит от вращательного движения флуоресцентной молекулы во время жизни флуоресценции. Если молекула большая или связана с макромолекулой, ее вращательное движение ограничено, а излучаемый свет остается высоко поляризованным. И наоборот, если молекула небольшая и свободна в растворе, ее вращательное движение быстрое, а излучаемый свет становится деполяризованным.
Поляризация флуоресценции определяется количественно по поляризационному значению (P), которое определяется как разница между интенсивностью вертикально и горизонтально поляризованных компонентов излучаемого света, разделенного на их сумму:
[P = \ frac {i _ {\ parallel} -i _ {\ perp}} {i _ {\ parallel}+i _ {\ perp}}]
где (i _ {\ parallel}) является интенсивностью вертикально поляризованного излучаемого света, а (i _ {\ perp}) - интенсивность горизонтально поляризованного излучаемого света.
Инструментация для измерения поляризации флуоресценции
Для измерения поляризации флуоресценции вам нужен детектор флуоресценции, оснащенный поляризационной оптикой. Наша компания предлагает широкий спектр качественных детекторов флуоресценции, включаяИзотермический флуоресцентный детекториЦифровой изотермический детектор флуоресценции, которые специально разработаны для точных и чувствительных измерений FP.
Эти детекторы обычно состоят из следующих компонентов:
- Источник света: Источник света, такой как ксеноновая лампа или лазер, используется для создания света возбуждения. Свет должен быть поляризован, прежде чем он достигнет образца.
- Поляризаторы: Поляризаторы используются для контроля поляризации возбуждения и излучения света. Поляризатор возбуждения помещается на путь света возбуждения, чтобы гарантировать, что он линейно поляризован. Поляризатор эмиссии помещается перед детектором для измерения вертикально и горизонтально поляризованных компонентов испускаемого света.
- Держатель образца: Держатель образца используется для удержания образца на пути света возбуждения. Он должен быть разработан, чтобы минимизировать рассеяние света и фоновую флуоресценцию.
- Детектор: Фотографист, такой как фотоэлеммативная трубка (PMT) или зарядное устройство (CCD), используется для измерения интенсивности испускаемого света. Детектор должен быть в состоянии измерить интенсивность вертикально и горизонтально поляризованных компонентов отдельно.
Экспериментальная установка для измерений поляризации флуоресценции
Следующие шаги участвуют в настройке эксперимента для измерения поляризации флуоресценции:
- Выберите соответствующий флуоресцентный зонд: Выберите флуоресцентный зонд, который подходит для вашего приложения. Зонд должен иметь высокий квантовый выход и длительный срок службы флуоресценции.
- Подготовьте образец: Подготовьте образец, растворяя флуоресцентный зонд в подходящем буфере. Если вы изучаете взаимодействие связывания, добавьте лиганд или макромолекулу в образцо в соответствующей концентрации.
- Калибровать инструмент: Калибровать детектор флуоресценции в соответствии с инструкциями производителя. Это может включать в себя регулировку усиления детектора, установку длина волн возбуждения и излучения, а также измерение фоновой флуоресценции.
- Измерить значения поляризации: Поместите образец в держатель образца и измерьте интенсивности вертикально и горизонтально поляризованных компонентов испускаемого света. Рассчитайте поляризационное значение, используя формулу, упомянутую выше.
Факторы, влияющие на измерения поляризации флуоресценции
Несколько факторов могут повлиять на точность и надежность измерений поляризации флуоресценции:
- Температура: Вращательное движение флуоресцентной молекулы зависит от температуры. Повышение температуры приводит к увеличению вращательного движения и уменьшению поляризационного значения. Следовательно, важно поддерживать постоянную температуру во время измерения.
- Вязкость растворителя: Вязкость растворителя влияет на вращательное движение флуоресцентной молекулы. Более вязкий растворитель ограничивает вращательное движение и увеличивает поляризационное значение.
- Концентрация флуоресцентного зонда: Концентрация флуоресцентного зонда может влиять на поляризационное значение. При высоких концентрациях может возникнуть самоопределение и агрегация зонда, что приводит к неточным измерениям.
- Фотообеспечение: Фотообеспечение - это необратимое разрушение флуоресцентной молекулы зажиганием возбуждения. Это может привести к снижению интенсивности флуоресценции и повлиять на измерение поляризации. Чтобы свести к минимуму фотообесцентрирование, используйте светлый свет интенсивности и короткие сроки экспозиции.
Применение поляризации флуоресценции
Флуоресцентная поляризация имеет широкий спектр применений в различных областях:
- Открытие наркотиков: FP используется для изучения взаимодействия связывания между лекарствами и их мишенями. Измеряя поляризационное значение, вы можете определить аффинность связывания и константу диссоциации комплекса лекарственного средства - мишени.
- Иммуноанализ: FP - Иммуноанализа на основе используются для обнаружения присутствия антигенов или антител в биологических образцах. Связывание антигена с антителом - меченным флуоресцентным зондом приводит к изменению значения поляризации, которое можно использовать для количественной оценки аналита.
- Анализ нуклеиновой кислоты: FP можно использовать для изучения гибридизации нуклеиновых кислот. Связывание флуоресцентно меченного олигонуклеотида с его комплементарной последовательности приводит к изменению значения поляризации, которое можно использовать для обнаружения и количественной оценки целевой нуклеиновой кислоты.
Устранение неисправностей измерений поляризации флуоресценции
Если вы столкнетесь с проблемами во время измерений поляризации флуоресценции, могут быть полезны следующие советы по устранению неполадок:
- Низкие значения поляризации: Если значения поляризации ниже, чем ожидалось, проверьте такие факторы, как высокая температура, низкая вязкость растворителя или высокая концентрация флуоресцентного зонда.
- Высокая фоновая флуоресценция: Высокая фоновая флуоресценция может быть вызвана примесями в образце или растворителе или путем рассеяния света. Очините образец и используйте чистый растворитель. Убедитесь, что держатель образца чистый и свободный от царапин.
- Противоречивые измерения: Несоответствующие измерения могут быть связаны с фотообесцвечиванием, плохим выравниванием поляризаторов или колебаниями в источнике света. Минимизируйте фотообеспечение, проверьте выравнивание поляризаторов и убедитесь, что источник света стабилен.
Заключение
Измерение поляризации флуоресценции является ценным методом для изучения связывающих взаимодействий и молекулярной динамики флуоресцентных молекул. Как поставщик детектора флуоресценции, мы стремимся обеспечить высокое качественное приборы и техническую поддержку, чтобы помочь вам добиться точных и надежных измерений FP. Работаете ли вы в области обнаружения лекарств, иммуноанализа или анализа нуклеиновых кислот, нашИзотермический флуоресцентный детекториЦифровой изотермический детектор флуоресценцииможет удовлетворить ваши потребности.
Если вы заинтересованы в покупке наших детекторов флуоресценции или у вас есть какие -либо вопросы об измерениях поляризации флуоресценции, пожалуйста, свяжитесь с нами для подробных консультаций и переговоров о закупках. Наша команда экспертов готова помочь вам в выборе наиболее подходящего инструмента для вашего приложения.
Ссылки
- Лакович, младший (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии. Springer Science & Business Media.
- Szollosi, J. & Damjanovich, S. (2004). Флуоресцентная поляризация: практическое руководство. В протоколах тока в цитометрии (стр. 1 - 17). John Wiley & Sons, Inc.