Система CRISPR - CAS произвела революцию в области редактирования генов из -за его простоты, высокой специфичности и эффективности. Однако, как и любая технология, это не без ограничений. Одной из проблем в применении CRISPR -CAS является достижение высокой редактирования генов с высокой эффективностью, особенно в сложных геномах и в определенных типах клеток. Рекомбиназы, ферменты, которые катализируют генетическую рекомбинацию, дают большие перспективы в повышении эффективности систем CRISPR - CAS. Как поставщик рекомбиназы, я рад изучить, как эти мощные ферменты могут быть интегрированы с CRISPR - CAS, чтобы разблокировать новые возможности в редактировании генов.
Понимание системы CRISPR - CAS
Система CRISPR - CAS является естественным защитным механизмом в бактериях и археи против вторжения вирусов и плазмид. Он состоит из направляющей РНК (GRNA), которая нацелена на определенную последовательность ДНК и нуклеазу CAS, которая расщепляет ДНК на целевом сайте. Как только ДНК расщепляется, в игру вступают в игру механизмы естественного восстановления ячейки. Существует два основных пути восстановления: не -гомологичный конец - соединение (NHEJ) и гомология - направленное восстановление (HDR). NHEJ является ошибкой - подверженным и часто приводит к небольшим вставкам или удалениям (Indels), в то время как HDR можно использовать для введения точных генетических изменений, когда предоставляется матрица донорской ДНК.
Эффективность CRISPR - CAS -опосредованного редактирования генов зависит от нескольких факторов, включая доставку нуклеазы и грНК CAS в клетки -мишени, активность нуклеазы CAS в месте -целевом месте и эффективность путей репарации ДНК. Во многих случаях низкая эффективность HDR является основным узким местом, особенно в первичных клетках и in vivo.
Как рекомбиназы могут повысить эффективность CRISPR - CAS
1. Облегчение гомологии - направленное восстановление (HDR)
Рекомбиназы могут играть решающую роль в продвижении HDR. Одним из ключевых шагов в HDR является инвазия шаблона донорской ДНК в расщепленную ДНК на месте -мишени. Рекомбиназы, такие как Reca у бактерий, могут образовывать нуклеопротеиновую нить на донорской ДНК. Эта нить может затем искать гомологичные последовательности в расщепленной ДНК и способствовать инвазии Strand, что является критическим шагом в HDR.
Например, путем предоставления рекомбиназы с системой CRISPR - CAS и шаблоном донорской ДНК, мы можем увеличить вероятность успешных событий HDR. Было показано, что этот подход значительно повышает эффективность точного редактирования генов в различных типах клеток. Рекомбиназа помогает преодолеть кинетические барьеры, связанные с HDR, что делает их более вероятной для клетки использовать матрицу донорской ДНК для восстановления, а не прибегать к ошибке - склонным к пути NHEJ.
2. Улучшение специфичности нацеливания
В дополнение к продвижению HDR, рекомбиназы также могут повысить специфичность нацеливания системы CRISPR - CAS. Некоторые рекомбиназы обладают способностью распознавать и связываться со специфическими последовательностями ДНК с высокой аффинностью. Разработав рекомбиназу для взаимодействия с комплексом CRISPR - CAS, мы можем увеличить специфичность нуклеазы CAS для целевого сайта.
Это может быть достигнуто путем объединения рекомбиназы с нуклеазой CAS или с помощью системы нацеливания на основе рекомбиназы в сочетании с CRISPR - CAS. Рекомбиназа может помочь направить нуклеазу CAS к правильному целевому сайту, уменьшая эффекты целевых. Выкл. Целевые эффекты являются серьезной проблемой в приложениях CRISPR - CAS, поскольку они могут привести к непреднамеренным генетическим изменениям и потенциальным вопросам безопасности. Улучшивая специфичность нацеливания, рекомбиназы могут сделать систему CRISPR - CAS более надежной и безопасной для использования в генной терапии и других применениях.
3. Преодоление барьеров хроматина
Структура хроматина может создать значительный барьер для доступа к системе CRISPR - CAS к ДНК -мишени. ДНК в эукариотических клетках тесно упакована с гистоновыми белками с образованием хроматина, что может ограничить связывание нуклеазы и GRNA CAS с сайтом -мишенью. Рекомбиназы могут помочь преодолеть эти хроматинские барьеры.
Некоторые рекомбиназы имеют способность взаимодействовать с хроматиновыми белками и модифицировать структуру хроматина в окрестностях сайта -мишени. Это может сделать целевую ДНК более доступной для системы CRISPR - CAS, повышая эффективность редактирования генов. Например, используя рекомбиназу, которая может реконструировать хроматин, мы можем усилить связывание нуклеазы и GRNA CAS с сайтом -мишенью, что приводит к более эффективному расщеплению ДНК и последующему восстановлению.
Наши продукты рекомбиназы и их потенциал в улучшении CRISPR - CAS
Как поставщик рекомбиназы, мы предлагаем ряд высококачественных рекомбиназных продуктов, которые подходят для повышения эффективности систем CRISPR - CAS. Наши рекомбиназы тщательно очищаются и охарактеризованы для обеспечения оптимальной производительности в приложениях для редактирования генов.
В дополнение к нашим продуктам рекомбиназы, мы также предлагаем другие ферменты, которые можно использовать в сочетании с CRISPR - CAS и рекомбиназ для дальнейшего повышения эффективности редактирования генов. Например,Экзонуклеаза III 2.0Может использоваться для обработки концов шаблона донорской ДНК, что делает его более подходящим для HDR.М - MLV H - 2,0может использоваться для обратной транскрипции, которая может быть полезна в некоторых стратегиях редактирования генов. ИДНК -полимераза 2.0Может использоваться для синтеза шаблона донорской ДНК или для заполнения пробелов в процессе восстановления.
Тематические исследования и приложения
Было проведено несколько успешных тематических исследований, демонстрирующих использование рекомбиназ для повышения эффективности CRISPR - CAS. В одном исследовании исследователи использовали систему CRISPR - CAS -рекомбиназы для коррекции генетической мутации в плюрипотентных стволовых клетках, индуцированных человеком (IPSCS). Поставляя рекомбиназу с компонентами CRISPR - CAS и шаблоном донорской ДНК, они смогли достичь значительно более высокой эффективности HDR по сравнению с использованием одной системы CRISPR - CAS. Этот подход имеет потенциальные применения в генной терапии для генетических заболеваний, поскольку он позволяет точно коррекции заболевания - вызывая мутации.
В другом случае рекомбиназы использовались для улучшения специфичности нацеливания системы CRISPR - CAS в растениях. Инженерная система на основе рекомбиназы, основанная на основе системы, исследователи смогли уменьшить эффекты от целевых и повысить эффективность редактирования генов на сельскохозяйственных растениях. Это имеет значение для сельскохозяйственной биотехнологии, так как его можно использовать для развития сельскохозяйственных культур с улучшенными признаками, такими как устойчивость к заболеваниям и увеличение урожайности.
Заключение и призыв к действию
Рекомбиназы имеют большой потенциал в повышении эффективности систем CRISPR - CAS. Продвигая HDR, улучшая специфичность нацеливания и преодоление барьеров хроматина, рекомбиназы могут учитывать некоторые ключевые ограничения технологии CRISPR - CAS. Как поставщик рекомбиназы, мы стремимся предоставлять высококачественные продукты и техническую поддержку для исследователей и биотехнологических компаний, работающих в области редактирования генов.
Если вы заинтересованы в изучении использования рекомбиназ для улучшения ваших приложений CRISPR - CAS, мы приглашаем вас связаться с нами для получения дополнительной информации. Наша команда экспертов может помочь вам выбрать правильные продукты рекомбиназы и предоставить руководство по экспериментальному дизайну. Мы с нетерпением ждем возможности поработать с вами, чтобы продвинуть область редактирования генов и принести новые решения.
Ссылки
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA, & Charpentier, E. (2012). Программируемая двойная РНК -управляемая эндонуклеаза ДНК при адаптивном бактериальном иммунитете. Science, 337 (6096), 816 - 821.
- Мали, П., Ян, Л., Эсвельт, К.М., Аач Дж., Гуэлл М., Дикарло, JE, ... & Church, GM (2013). РНК - управляемая инженериями генома человека с помощью науки CAS9, 339 (6121), 823 -
- Li, X., Yang, Y. & Zhang, Y. (2016). Рекомбинирирование: гомологичный метод генетической инженерии, основанный на рекомбинации. Природные протоколы, 11 (3), 476 - 492.
- Pinder, JC, & Cheng, AW (2019). Улучшение редактирования генов CRISPR - CAS9 с помощью ДНК - нацеливание рекомбиназ. Методы в молекулярной биологии, 1970, 273 - 285.